Объекты исследования:

В проекте исследуются параметры биохимического метаболизма (липидного, белкового, углеводного и энергетического) в развитии атлантического лосося Salmo salar L., кумжи Salmo trutta L., горбуши Oncorhynchus gorbuscha Walb., воспроизводящихся и обитающих в различных биотопах водоемов Северо-Запада России на всех стадиях роста и развития от оплодотворения и эмбрионального развития до формирования молоди.












Водные беспозвоночные (макрозообентос) из лососевых рек бассейна Белого моря, а также рек бассейна Онежского и Ладожского озер.











Методы и подходы научно-исследовательского проекта.

В настоящем проекте исследуется биохимический статус эмбрионов, личинок (сразу после выхода на поверхность грунта), мальков (сеголеток к завершению летнего питания; годовиков и двухлеток после зимовки и к завершению летнего питания; смолтов лососевых рыб (в период ската) от разных ходовых групп. Параллельно изучается реореакция молоди лосося и кумжи (пестрятки возрастом 0+ – 3+ и смолты), а также скатывающихся на нагул в море мальков горбуши.



Ведется сравнительный анализ биохимического статуса и компонентов реореакции молоди всех трех видов разных возрастных групп.

Проводится оценка кормности лососевых, кумжевых и лососево-кумжевых рек путем оценки количества и биохимического качества основных видов макрозообентоса, который питается молодь лососевых рыб.

В полевых условиях исследуются поведенческие механизмы и гидрологические условия образования фенотипических групп, ведется оценка различия кормовой базы (по биохимическим показателям) и физическое воздействие потока как модулятора биохимического статуса молоди лосося и кумжи.

1. Методы полевых исследований:

Отлов молоди рыб проводится с помощью электролова Fa-2 (Norway), взрослых – орудиями лова и на рыбоучетном заграждении;

Вылов дрифта и бентоса беспозвоночных организмов будет проведен с помощью специальных ловушек и сачков;

Эксперименты по реореакции проведены в сконструированных нами и запатентованных оригинальных реоградиентной и оптомоторной установках;

2. Биохимические показатели, методы и подходы экспериментальных исследований:

Для выполнения поставленных задач в проекте используется комплексный подход, при котором наряду с методами, используемыми в ихтиологии и гидробиологии для характеристики гидробионтов будут использованы классические методы физико-химической биологии (тонкослойная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, газовая хроматография, электрофорез, спектрофотометрия, гель-хроматография, иммуноблотинг, дифференциальное центрифугирование и др.) и молекулярной биологии (ПЦР в реальном времени, секвенирование), а также методы гистологического анализа для изучения структуры тканей.

2.1. Липидный статус, как один из интегральных показателей уровня обмена веществ, может служить биохимическим индикатором состояния организма рыб и отражать процессы внутрипопуляционной дифференцировки и развития, а вариации уровня жирнокислотного состава способствуют оптимальному протеканию процессов жизнедеятельности и адаптации к изменяющимся факторам среды или степени готовности к ним (например, миграции в море). Жирные кислоты являются одним из липидных компонентов, которые наиболее быстро включаются в адаптивные реакции организма.

При выполнении проекта ведется определение следующих биохимических параметров липидного обмена: общие липиды и отдельные липидные классы, такие как запасные липиды – триацилглицерины, эфиры холестерина и воска, структурные липиды – фосфолипиды, холестерин, установлен состав и количество фосфолипидных фракций – фосфатидилхолин, фосфатидиэтноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, лизофосфатидилхолин и сфингомиелин, а также изучается жирнокислотный состав общих липидов.




2.2. Исследуется роль внутриклеточного протеолиза, играющего важнейшую регуляторную роль в процессах развития организмов, для этого ведется оценка изменения активности основных ферментов лизосомального протеолиза (катепсинов В и Д, КФ3.4.22.1 и КФ3.4.23.5., соответственно), а также активности кальцийзависимых протеиназ цитозоля (кальпаинов, КФ3.4.22.17) и их молекулярных форм, и химотрипсинподобную (ХПА) активность протеасомы.








2.3. Изучается динамика и уровень активности ферментов, катализирующих важнейшие реакции энергетического и углеводного обмена, в т.ч.: цитохром с оксидазы (ЦО, КФ 1.9.З.1.), лактатдегидрогеназы (ЛДГ, 1.1.1.27), альдолазы (КФ 4.1.2.13), малатдегидрогеназы (МДГ, 1.1.1.37), 1-глицерофосфатдегидрогеназы (1-ГФДГ, 1.1.1.8) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ, 1.1.1.49); видо- и тканеспецифичность изоферментного состава некоторых дегидрогеназ, кинетические параметры реакций Vmax и Кm.




2.4. Ведутся исследования биохимических и молекулярных механизмов регуляции мышечного роста (миогенеза) у лососевых рыб в зависимости от возраста, стадии жизненного цикла, сезона и места обитания, условий среды. Это позволит наиболее детально исследовать метаболические и молекулярно-генетические факторы, определяющие процессы активного роста рыб и регуляцию миогенеза, выявить общие закономерности, позволяющие в дальнейшем прогнозировать характер развития рыб и способность их к адаптации в определенных трофо-экологических условиях.

С использованием молекулярно-генетических методов, в т.ч. ПЦР-анализа, будут определены: показатель соотношения нуклеиновых кислот РНК/ДНК, отражающий уровень биосинтеза белка, уровень экспрессии гена тяжелой цепи миозина - основного мышечного белка, а также регуляторного белка - миостатина и транскрипционных факторов регуляции процесса миогенеза (MyoD, Myf5, миогенин).


2.5. Проводится гистоморфологический анализ гонад и печени лососевых рыб с использованием современного гистологического оборудования.











2.6. В работе используются классические методы определения гормонального статуса (тироксина (Т4) и трийодтиронина (Т3), а также тестостерона и эстрадиола-17β в сыворотке крови) развивающегося организма. Данный блок работ выполняется соисполнителями проекта из ИПЭЭ РАН (заключен Договор на выполнение НИР на 2014-2015 гг.). Показана взаимосвязь биохимических метаболических путей в развитии адаптивных приспособлений развития исследуемых рыб.

Такой комплексный и всесторонний подход с применением различных методов общей и физико-химической биологии при изучении репродукции и развития уникальных и экологически значимых лососевых рыб в экосистемах северных широт будет применен впервые.

Исследования проводятся с использованием современного оборудования на базе лаборатории экологической биохимии и ЦКП НО ИБ КарНЦ РАН (04.02.2009 г. Приказ №31-а).

Результаты исследования анализируются и обрабатываются методами статистического анализа и для этой цели будут использован метод главных компонент (МГК), корреляционный и регрессионные методы, которые активно применялись авторами ранее и показали достоверность полученных результатов.