В 2016 г. проведены полевые работы на реках бассейнов Белого моря, Онежского и Ладожского озер.Исследованы различные типы биотопов нерестово-выростных участков (НВУ) лососевых рыб. Выявлен комплекс гидрологических факторов, определяющих условия первичного расселения личинок и обитания разновозрастной молоди атлантического лосося Salmo salar L. и кумжи Salmo trutta L., ее выживаемость, время наступления смолтификации и ската в нагульные водоемы. Собран биологический материал: икра горбуши Oncorhynchus gorbusha перед оплодотворением и в период эмбрионального развития из нерестовых бугров (под льдом), молодь лосося и кумжи разных возрастных групп (0+, 1+, 2+, 3+, 4+) и на разных стадиях жизненного цикла (сеголетки, пестрятки, смолты), макрозообентос.
Определяли состав общих липидов (ОЛ), запасных липидов – триацилглицеринов (ТАГ) и эфиров холестерина (ЭХС), структурных липидов – фосфолипидов (ФЛ) и их фракций (фосфатидилсерина (ФС), фосфатидилэтаноламина (ФЭА), фосфатидилинозитола (ФИ), фосфатидилхолина (ФХ), лизофосфатидилхолина (ЛФХ), сфингомиелина (СФМ), холестерина (ХС) и жирных кислот (ЖК) – насыщенных (НЖК), мононенасышенных (МНЖК), полиненасыщенных (ПНЖК) общих липидов. Определяли активность ключевых ферментов, аэробного и анаэробного синтеза АТФ, образования глицерофосфата из промежуточных продуктов распада углеводов и пентозо-фосфатного пути окисления углеводов: лактатдегидрогеназы (ЛДГ, EC 1.1.1.27), малатдегидрогеназы (МДГ ,EC 1.1.1.37), глицерофосфатдегидрогеназы (1-ГФДГ, EC1.1.1.8) глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ, EC 1.1.1.49), альдолазы (EC 4.1.2.13), цитохром с оксидазы (ЦО,EC 1.9.З.1). Определяли уровень экспрессии генов тяжелой цепи миозина, MyoD, Myf-5, миогенина. Исследована активность ферментов внутриклеточного протеолиза: кальцийзависимых нейтральных протеиназ цитозоля (EC 3.4.22.17), химотрипсиноподобной активности протеасомы, кислых протеиназ лизосом - катепсинов В (EC 3.4.22.1) и D (EC 3.4.23.5), а также лизосомальных кислых ДНКазы (EC 3.1.4.6) и РНКазы (EC 3.1.4.23), альфа-гликозидазы (ЕС 3.2.1.21) и бета-галактозидазы (ЕС 3.2.1.23). Изучен гормональный статус: уровень тироксина (Т4) и трийодтиронина (Т3), а также тестостерона и эстрадиола-17β в сыворотке крови.
Полученные результаты обработаны общепринятыми методами вариационной статистики с использованием регрессионного, дисперсионного, компонентного и дискриминантного методов. Следует подчеркнуть, что исследования биохимического статуса лососевых рыб проводили на рыбах, обитающих в природных водоемах, где организмы испытывают воздействие целого ряда факторов.
В 2016 году получены следующие научные результаты:
1. Показано, что у молоди лососевых рыб разных возрастных групп (0+, 1+, 2+, 3+, 4+) и на разных стадиях жизненного цикла (пестрятки, смолты) усиливается чувствительность к потоку и способность удерживаться на высоких скоростях течения. Реореакция влияет на активное перераспределение мальков в первый год жизни и формирование пространственно-временной динамики распределения разновозрастных пестряток лосося и кумжи. В целом, локомоторные показатели, сила тяги одновозрастной молоди лосося и кумжи отличаются в пользу кумжи, т.к. темп ее роста выше. Соответственно, кумжа более вынослива при сильных паводках, которые характерны для малых рек. Обнаружена взаимосвязь показателей локомоторной компоненты реореакции разновозрастной молоди лососевых рыб с их биохимическим статусом (липидным, углеводным, состоянием внутриклеточного протеолиза), что объясняется необходимостью в энергетических затратах на удержание в потоке и двигательную активность.2. Результаты исследований биохимического статуса разновозрастной молоди атлантического лосося, горбуши, кумжи, а также икры на этапе оогенеза и эмбриогенеза, подтверждают данные, полученные ранее при выполнении проекта, о существовании биохимической разнокачественности особей в генерациях этих видов рыб, которая может обуславливать раннюю дифференциацию личинок и мальков одной генерации, приводящую к образованию сложной субпопуляционной и возрастной структуры всей популяции. Метаболизм личинок, при выходе из нерестовых гнезд, с одной стороны несет в себе черты генетической разнокачественности, сформировавшейся еще в оогенезе и эмбриогенезе, а с другой стороны изменяется с начала самостоятельной жизнедеятельности личинки. Эти результаты указывают на существование биохимических механизмов, лежащих в основе фенотипической и физиологической изменчивости особей и проявлении у них адаптивных возможностей, позволяющих приспосабливаться к динамичности условий окружающей среды и определять стратегию своего дальнейшего развития.
2.1. Биохимические исследования липидных и жирнокислотных спектров, активности ферментов энергетического и углеводного обмена, а также данные гистоморфологического анализа в преднерестовой икре из разных частей ястыков (головной, центральной и хвостовой) горбуши не показали достоверных различий между ними. При этом результаты статистического анализа всей выборки икринок демонстрируют разнокачественность икры по активности альдолазы (коэффициент вариации - 67 %), ЛДГ (34 %) и концентрации белка (96 %). Кроме того, для всей выборки икры выявлено наличие положительной корреляции между ЛДГ и альдолазой (r=0,50); ЛДГ и массой гонад (r=0,56); концентрацией белка c ЛДГ (r=0,49), c альдолазой (r=0,45), c массой гонад (r=0,50). Показано, что уже на стадии неоплодотворенной икры формируется разнокачественность по уровню некоторых ключевых процессов энергетического и углеводного метаболизма. Ранее такая разнокачественность была продемонстрирована и для некоторых параметров липидного обмена. Аномалий в развитии ооцитов не выявлено, что определяет их качество и позволяет делать прогнозы о ее высокой способности к оплодотворению и потенциале дальнейшего развития эмбрионов.
2.2. Установлены особенности в разнокачественности отдельных биохимических показателей у горбуши в эмбриогенезе на этапе пигментации глаз, который характеризуется значительными морфологическими, физиологическими и биохимическими преобразованиями. Ранее такая же разнокачественность по биохимическому статусу была показана для эмбрионов лосося и кумжи. При сравнении результатов исследований липидного, углеводного и энергетического обмена у трех видов лососевых рыб установлено, что кумжа имела наименьшую степень разнокачественности, а горбуша - наибольшую. Видовых различий в уровне активности исследованных протеиназ и лизосомальных ферментов у разных видов лососевых рыб выявлено не было, что подтверждает универсальность протеолитических механизмов регуляции эмбрионального развития лососевых рыб.2.3. Сравнительное исследование липидного статуса преднерестовой икры горбуши и в процессе ее развития - на стадии пигментации глаз и у выклюнувшихся предличинок показало снижение уровня ФЛ, в том числе ФХ и повышение минорных фосфолипидов (ФИ, ФС, ФЭА, СФМ), а также ХС, показателя ХС/ФЛ, особенно у предличинок. Накопление ФИ и ФС - минорных ненасыщенных ФЛ индуцирует активность мембранных ферментов, в том числе комплекса Na+,K+-ATФазы, связанного с осморегуляцией. Повышение уровня ХС и показателя ХС/ФЛ у выклюнувшихся предличинок по сравнению со стадией пигментации глаз способствует стабилизации клеточных мембран, увеличивая их вязкость и уменьшая подвижность жирнокислотных цепей. В результате таких изменений снижается пассивная проницаемость клеточной мембраны для ионных токов, функциональная активность клеточных рецепторов и мембраносвязанных ферментов.
2.4. Показаны биохимические различия двух групп предличинок горбуши, развивающихся в разных гнездах (10 м друг от друга; закладка икры на развитие была произведена с разницей во времени в одну неделю; средний вес личинок из 1 гнезда - 1.3 г, из 2-го – 1.6) при одинаковых внешних условиях. При сравнении содержания общих липидов, их отдельных классов и жирных кислот у двух групп предличинок (пробы собраны одновременно) установлены различия в уровне общих липидов, в том числе ХС, показателей ХС/ФЛ, 18:3n-3/18:2n-6, 16:0/18:1n-9. Пониженный уровень ХС и особенно показателя ХС/ФЛ у предличинок из второго гнезда свидетельствует о снижении вязкости биомембран и повышении метаболической активности. Особо следует отметить, что предличинки из двух гнезд достоверно отличаются содержанием суммарных МНЖК, НЖК и ПНЖК семейства n-6, но не отличаются таковым суммарных ПНЖК, в том числе семейства n-3 ПНЖК. Метаболизм личинок из второго гнезда отличался более высоким уровнем аэробного метаболизма, окисления углеводов в процессе гликолиза и их превращением в глицерофосфат (предшественник структурных и запасных липидов). Эти результаты имеют значение для прогноза сроков вылупления личинок горбуши из оболочек и выходу их из нерестовых гнезд.
2.5. Выявлены изменения биохимического статуса, обусловленные процессами смолтификации, а также условиями местообитаний (прежде всего, гидрологическими и кормовыми) у молоди кумжи из рек Кольского полуострова (Кривой ручей, Ольховка, Индера). Высокий липидный статус (повышенное содержание ФЛ и ТАГ) у сеголеток по сравнению со старшей молодью кумжи обусловлено качеством, доступностью и массовостью кормовой базы, интенсивностью питания, что способствует активному перемещению и дает определенные преимущества в выборе места обитания. Показаны различия в механизмах регуляции миогенеза (MRFs: MyoD, Myf5, миогенина) и процессах формирования мышечной ткани (гиперплазии и гипертрофии) у разных возрастных групп пестряток и смолтов кумжи. Для первых лет жизни характерна высокая интенсивность процессов формирования мышечной ткани и темпов их роста. У смолтов основной прирост мышечной массы происходил за счет гипертрофии имеющихся волокон, скорость образования новых снижалась. Показано различие в динамике активности внутриклеточных протеиназ (кальпаинов и протеасомы) у разных возрастных групп и на разных стадиях жизненного цикла (пестрятки, смолты) кумжи, подтверждающее особенности смолтификации лосося и кумжи: смолтификация лосося, перестройка его осморегуляторной системы завершается в речной период, смолты кумжи могут мигрировать в море даже при незавершенной смолтификации. Установленные особенности метаболизма у молоди кумжи из разных местообитаний и на разных этапах жизненного цикла (пестрятка и смолт) необходимы, по-видимому, для формирования адаптивных возможностей молоди при последующем переходе к морскому образу жизни. Вариации интенсивности и направления изученных ключевых метаболических реакций обеспечивают поддержание энергетического гомеостаза, выбор стратегии эффективного расходования запасных ресурсов, регуляцию синтеза структурных и запасных веществ, а также определяют возможности адаптации каждой из групп кумжи в соответствии с возрастными потребностями, гидрологическими, экологическими и кормовыми условиями рек.
2.6. Выявлено, что в составе зообентоса доминируют амфибиотические насекомые (87% как по численности, так и по биомассе), являющиеся основными кормовыми объектами лососевых рыб в реках. Несмотря на относительно низкие количественные характеристики зообентоса, большая доля амфибиотических насекомых обуславливает высокое качество кормовой базы для кумжи, которое определяется высоким содержанием в ее составе ПНЖК 20:5(n-3) и 18:3(n-3), особенно у ручейника Rhyacophila nubila. При анализе жирнокислотного спектра молоди кумжи из р. Орзега было показано, что стабильность регуляции жизненных функций в процессе роста и развития (включая готовность к смолтификации) обеспечивается не только количеством пищевых жирных кислот, но и их соотношением 18:2n-6/18:3n-3, как нами было ранее установлено: «кумжа vs. макрозообентос: 1.66 vs. 1.31».2.7. Получены новые данные об уровне тиреоидных и половых стероидных гормонов в крови кумжи из р. Орзега, и рек Б.Уя, Шокша (Онежское озеро), Алатс-оя (Ладожское озеро). Выявленные различия по массе и длине тела, уровню тиреоидных гормонов в крови между кумжей, обитающей в р. Орзега и рыб из трёх других указанных рек обусловлены возрастом. Разработан подход к оценке физиологического состояния лососевых рыб, основываясь на уровне в их крови тиреоидных и половых стероидных гормонов.
