В сентябре настоящего года сотрудники лаборатории экологической биохимии - Кочнева Альбина, Филиппова Ксения и Воронин Виктор – прошли курс обучения по пробоподготовке сложных биологических образцов с целью их дальнейшего исследования с помощью масс-спектрометрических методов. Процесс обучения происходил на базе ЦКП «Протеом человека» ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» (ИБМХ) (ссылка: http://proteocenter.ibmc.msk.ru/?page_id=680) в г. Москва. Преподаватели курса – сотрудники лаборатории системной биологии ИБМХ (http://www.ibmc.msk.ru/?page_id=254).
Программа обучения включала в себя следующие этапы:
1. Подготовка сложных биологических проб для протеомного анализа;
2. Панорамная хромато-масс-спектрометрия для анализа сложных белковых смесей;
3. Программное обеспечение для идентификации и сравнительного анализа белков.
В качестве объекта исследования был выбран представитель класса Ленточные черви (Cestoda), гельминт Schistocephalus solidus, который является паразитом рыб. За период обучения был изучен состав белков плероцеркоидов (личинок) S. solidus, паразитирующих в полости тела трёхиглой колюшки Gasterosteus aculeatus (промежуточный хозяин), являющейся одной из массовых видов рыб прибрежной пелагической зоны Белого моря летом (в нерестовый период). На заметку: Паразитическая система S. solidus – трехиглая колюшка Gasterosteus aculeatus является классической моделью для изучения ряда фундаментальных биологических проблем, например, таких как сопряженная эволюции паразита и его хозяина, влияния инвазии на поведение и плодовитость хозяина. Однако, биохимические особенности жизнедеятельности червя S. solidus, остаются практически не изученными. В рамках данной работы изучается состав белков (протеома) гельминта S.solidus, что позволит расширить и уточнить наши знания о взаимоотношениях в системе «хозяин-паразит», в частности выявить молекулярные механизмы эволюционной адаптации гельминтов к паразитическому образу жизни и способы выживания паразита в агрессивных условиях среды внутри тела хозяина. Изучение протеома гельминта S.solidus позволит дополнить существующие представления в решение отдельных фундаментальных проблем паразитологии, так и полученные результаты можно использовать для решения серии прикладных задач, связанных с разработкой алгоритмов поиска молекул (маркеров), которые можно использовать при разработке перспективных вакцин для борьбы с паразитозами человека и сельскохозяйственных животных. Исследования данной паразитической системы проводятся в базе лаборатории экологической биохимии в рамках проекта РФФИ № 17-04-01700 «Изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе жизнедеятельности и экологии представителей класса цестоды методами протеомики».
Анализ протеома гельминта включал все этапы пробоподготовки, хроматографического разделения и масс-спектрометрического анализа образцов.
Пробоподготовку биологических образцов проводили по протоколу FASP (Filter Aided Sample Preparation), который заключался в растворении белковых проб в детергенте, далее с помощью фермента трипсина осуществляется расщепление белка (т.е. гидролиз белков в растворе) и затем анализ полученных пептидов проводят с помощью масс-спектрометрии. Более подробно с методикой FASP можно ознакомиться по ссылке: http://www.proteomicsresource.washington.edu/protocols03/FASPprotocols.php.
Масс-спектрометрический анализ пептидов осуществляли с использованием ВЭЖХ системы Ultimate 3000 RSLCnano («Thermo Scientific», США), гибридного орбитального масс-спектрометра Orbitrap Q-Exactive HF-X («Thermo Scientific», США) в режиме положительной ионизации в источнике NSI. Обработку масс-спектров и идентификацию белков проводили с использованием программы «SearchGUI v.3.3.7» с помощью поискового алгоритма «X!Tandem» по базе данных «Uniprot» с ограничением по виду исследуемого организма. Для визуализации полученных результатов поиска и формирования отчета в виде соответствующих таблиц использовали программу «PeptideShaker v.1.16.34». Кроме того, в ходе обучения были продемонстрированы и другие поисковые системы: «SkyLine», «MaxQuant» и «ProgenesisQI».Итак, за период обучения была освоена методика пробоподготовки сложных биологических образцов, прослушана лекция по планированию протеомных экспериментов (лектор – В.Г. Згода), получены знания о различных видах масс-спектрометров и их устройстве, принципах работы (квадрупольных, тройных квадрупольных, времяпролётных, орбитальных ловушек, ионных ловушек и их комбинаций) в тандеме с хроматографами, а также освоена процедура обработки масс-спектров и идентификации компонентов пробы при помощи различных поисковых систем и баз данных.
Искренняя благодарность за организацию и проведение обучающего курса преподавателям, специалистам лаборатории системного анализа ИБМХ (проф. Згоде В.Г., а также инж. Хряповой Е.А.) и руководителю ЦКП "Протеом человека" (О.В. Тихоновой).
